哥伦布年的航行和发现轰动了西班牙和欧洲。西班牙国王王后也正式确认了圣塔菲协定许给哥伦布的一切权益。西班牙君主的用人*策与葡萄牙不同，他们并不把一个功成名就的人羁留宫中，闲置不用；而是让他干老本行，为王朝和国家服务。他们也不用担心功大盖主，因为哥伦布毕竟是一名客卿、外籍官员。哥伦布也耽于功名，很想继续建功立业。驱逐了摩尔人后无所事事的贵族和形形色色的人也很想到海外去发展和发财，于是在哥伦布首次远航归来后半年，西班牙又组织了第二次远航。
这一次共纠集了17艘船，约人。乘员中还有官员、教士、农夫、手工业工匠。他们携带了大批口粮、农作物种子、家畜、生产工具、采矿工具、武器弹药、猎犬等等。从这支船队的规模、乘员和载物来看，这次远航与上次远航的目的和性质已大有不同。上次主要是寻找到东方的新航路，与中国、日本、印度等国通商。这次虽然也要继续从事探险与发现，但主要是拓殖。船队于9月25日从西班牙加的斯港出发，到加那利群岛后转向西南。
他们利用东北季风之助，仅用20个昼夜便横渡了大西洋。这次比上次偏南约10纬度的航线以后成了从欧洲去西印度常走的航线。上半年返回时哥伦布已发现了最快捷的回欧洲航线，即与亚速尔群岛等纬度的航线。这样，在热带亚热带海域往返于新旧大陆之间的最佳航线都被哥伦布找到了。船队驶抵小安的列斯群岛，先后发现和经过了多米尼加岛、瓜德罗普岛、维尔京群岛、波多黎各岛等大小岛屿。
殖民与扩张
在瓜德罗普岛，西班牙人见到了当地野人吃人的种种迹象，并了解到一些有关加勒比人的情况。后来，本意为“善战、英勇”的加勒比人Carib这个词，除了演化成地名外，还衍生了西方语言中“吃人食肉者”cannibal等新词。11月22日，船队抵达伊斯帕尼奥拉（海地）东北角。他们沿海地北海岸航行，11月27日船队抵达纳维达德据点所在的海湾。西班牙人发现据点已被印第安人夷为平地，留守的39人也被消灭干净。据随行的昌卡医生的日记所载，这很可能是留守的西班牙人掳掠女人和到处搜寻*金引起印第安人反击所致。哥伦布遂在海地岛北岸中部另建伊莎贝拉城。
许多抱着淘金的目的而来，却不愿从事普通劳动的人感到失望，又为食品短缺和*热病、疟疾等瘟疫所迫，他们纷纷要求回国。哥伦布见状决定留下5艘船约人，其余的人分乘12艘船回国。年2月2日，他们由托雷斯率领返航，很快回到西班牙。月24日，哥伦布率3艘船离开伊莎贝拉去考察古巴。他们考察了整个古巴西南海岸，发现了牙买加岛、派恩斯岛（今青年岛）。
月底，哥伦布回到伊莎贝拉养病。据某部手稿，在哥伦布离开海地继续探险考察期间，从伊斯帕尼奥拉（海地）驶出了几条西班牙船，到达了玛格丽塔岛（今属委内瑞拉）附近的南美洲海岸。它们航行到巴拿马才返回。如果这次有争议的航行探险能被广泛接受，就意味着欧洲人此时便已开始发现南美大陆和中美地峡。哥伦布第二次航行到达西印度后，西班牙人与印第安人的冲突就不断发生。
在哥伦布离开海地继续探航期间，哥伦布的兄弟巴托罗缪率3艘船奉命前来补给，于年5月抵达。此前西班牙人在产金之地所设的圣托马斯要塞的指挥官纠集了几个人，抢夺了船只擅自回国。留下来的士兵水手无人管束，到处抢劫强奸，激起印第安人的反抗。他们打死了几十个西班牙人和病员，包围了圣托马斯要塞。由此在年3月底开始了西班牙入侵略征服海地的战争。
拥有火枪火炮、骑兵猎犬、弓弩甲胄的西班牙人很快击溃了手无寸铁的部落武装，征服了海地。哥伦布等强迫印第安人缴纳超量的金砂棉布。成百上千的印第安人在战斗中被打死，或被西班牙人奴役劳累而死，或被掳为奴隶在贩运途中死去，或染上了西班牙人带来的疾病天花、麻疹而病死，或不堪忍受奴役被迫轻生自杀，或因逃离了家乡离开了农田实行“坚壁清野”而饿死。海地印第安人急遽减少直到灭绝。西班牙人初到时，海地有土著居民25万以上。到年便只剩下6万人，到年便仅存人，到16世纪中叶便基本灭绝了。
年11月，托雷斯率4艘船从西班牙又奉命来到伊莎贝拉予以补给，并把西班牙远征队抓获的名印第安人中的人运回拍卖，余下的人中一部分让西班牙人领去当仆人，大部分释放。西班牙君主对哥伦布第二次远航所获并不满意，遂允许臣民到西印度自由移民、采金、考察，只需把收入的2/3上缴。这样，哥伦布曾拥有的对新发现的西印度的垄断权就被取消了。年10月，从西班牙来到伊莎贝拉视察的阿古亚多传达了国王们的敕令。哥伦布于年3月动身回国，6月中旬回到加的斯港。行前哥伦布让其弟巴托罗缪代理他统治西印度。
巴托罗缪当年在海地岛南岸修建了圣多明各城。圣多明各很快成为西班牙在海地殖民统治的中心，现在是多米尼加的首都。哥伦布的第二次远航在他的四次远航中规模最大、耗资最巨，达万马拉维迪。但他所到之地皆在加勒比海地区，故在地理发现方面没有重大的突破（与后来发现南美大陆、北美大陆、中美地峡、太平洋、麦哲伦海峡等相比）。从他第二次远航起，西班牙人一欧洲人再没有离开过美洲，往返于欧洲和西印度的白人的船只已接连不断，不再稀奇。美洲印第安人、特别是海地人，开始陷入被征服被统治被奴役被屠杀的境地。